产品及特点 该酶是突变型的 mmlv 逆转录 dna 聚合酶，从表达 moloney murine leukemia virus （莫洛尼氏鼠白血病病毒）reverse transcriptase 基因(pol 基因)的 e.coli 细胞中分离纯化而得，由一个分子量为 76.1 kda 的单亚基组成，可催化以单链 dna、rna 或 dna：rna 杂交链为模板的互补 dna 链的聚合反应。跟野生型相比,它没有 rnase h 活性。
1.延伸性能好，可合成长达 12.5 kb 的全长 cdna。
2.最反应温度为 42℃，但在 50℃时仍有活性，70℃10 分钟能使其失活。
3.能 以 cy3-，cy5-，rhodamine-， aminoallyl-，fluorescein 等 标 记 的
nucleotides 为底物。
4.可用于 first strand cdna 合成，second strand cdna 合成，dna labeling，rna primer extension 等。
5.与 pcr 兼容，rt 产物可以用于 pcr 和 real-time pcr。
6.能被金属螯合剂，无机磷酸，焦磷酸和多胺抑制。
7.没有 rnase h 活性。
规格及成分 成 份 编号 塑料袋包装
mmlv 逆转录酶，200u/μl 60905a 50 μl（绿盖）
5×rt buffer 60905b 1 ml（本色盖）
使用手册 60905sc 1 份
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有限期一年
使用方法 一：合成 pcr 用的 1st-strand cdna
1. 按下表配制 rt 反应体系:
成分 加入量
自备 rna 模板
总 rna 100-500 ng
或 poly(a) mrna 10-500 ng
或专一的 rna 0.01pg-500ng
注意：rna 样品不能有基因组 dna 污染。
自备引物
oligo (dt)18(0.5ug/μl) 1 μl
或随机引物(0.2ug/μl) 1 μl
或 rna 模板专一性引物 15-20pmol
注意：随机引物于 rna 模板的比例跟最后得到的
cdna 的平均长度成反比。
自 备 rnase-free 水 补水到 12 μl
2.70℃保温 5 分钟后立即冰浴。
3.再严格按下表顺序加入各成分：
5×rt buffer 4 μl
自备 rnase inhibitor (20u/μl) 1 μl自备 dntp (10 mm each) 2 μl
4.37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 gc rna 模板，可以改成
45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5
分钟）。
5.加入 1 μl (=200 u) mmlv 逆转录酶，反应终体积为 20μl。
6.42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟， 然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。
7.70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cdna 可以直接作为 pcr 模板使用，不需要纯化。
二：合成建文库用的 1st-strand cdna
1.按下表配制 rt 反应体系:
2.70℃保温 5 分钟后立即冰浴。
3.严格按下表顺序加入各成分
5×rt buffer 4 μl
rnase inhibitor (20u/μl) 1 μl
dntp (10 mm each) 2 μl
4.37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 gc rna 模板，可以改成
45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5
分钟）。
5.加入 1 μl (=200 u) mmlv 逆转录酶，反应终体积为 20μl。
6.42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟， 然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。
7.70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cdna 可以
用于第二链 cdna 的合成或放置在-20℃。
相关资料 储存 buffer：50 mm tris-hcl (ph 8.3)，0.1 m nacl，1 mm edta，5 mm dtt，0.1% (v/v) triton x-100 和 50% (v/v) glycerol 。
反应 buffer，5x：250 mm tris-hcl (ph 8.3 at 25℃)，250 mm kcl， 20 mm mgcl2，50 mm dtt。
活性定义
以 poly(ra)为模板，以 oligo(dt)12-18 为引物，在 37℃温度下，在 10 分钟将
1 nmol 的 dtmp 掺入到多核苷酸中所需酶量为一个单位。酶反应条件为: 50 mm tris-hcl (ph 8.3)，6 mm mgcl2，10 mm dtt，40 mm kcl，
0.5 mm dttp，0.4 mbq/ml [3h]-dttp，0.4 mm polya•oligo(dt)12-18 。纯度
sds-page 考马市亮蓝染色无杂带污染
图注: 10 μl 本产品在sds-page 中电
泳后染色照片。纯度》99%。m 表示蛋白质分子量对照。
关联产品 cdna 第一链合成试剂盒、一管式 rt-pcr 试剂盒
上海雅吉生物科技有限公司